荧光分光光度计及其应用

 

　　1基本原理当激发光照射某些物质时,处在基态的分子吸收激发光后跃迁为激发态,这些激发态分子在因转动、振动等损失一部分激发能量后,以跃迁下降到低振动能级,再从低振动能级下降到基态,在此过程中激发态分子将以光的形式释放出它们所吸收的能量,这种光称之为荧光,所得到的光谱称为荧光光谱。荧光光谱能够反映荧光物质的特性。荧光分光光度计是基于物质的这种性质而对其进行定性及定量分析的一种分析仪器。荧光定量分析的数学处理比分子吸收光谱复杂。一般来讲,荧光强度If等于分子所吸收辐射的光强度I a与量子效率的积,即If=f·I a=f I0(1-10-εbc)。如果荧光物质的浓度足够低,则If=2.3 f I 0εbc=kc。这就是荧光定量分析的理论公式,式中ε、b、c分别是摩尔吸光系数、液池厚度及被测物质的浓度。

 

　　2荧光分光光度计的基本结构荧光辐射是从样品发生的,其在所有方向发射都相同,原则上可以从任何角度进行观测。但从仪器设计和应用的观点来看,90°角度是方便且是目前使用较为广泛的方式。荧光分光光度计的基本结构是:光源※单色器或滤光片※样品池※单色器或滤光片※检测器。目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯,单色器多用光栅,检测器主要用光电倍增管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在200～900 nm。

 

　　3荧光分光光度计的分类

 

　　3.1滤光片式荧光计

 

　　3.1.1单光束滤光片荧光计单光束滤光片荧光计的工作原理是第1滤光片允许紫外线(激发光)通过,第2滤光片可以透射荧光辐射,但它吸收了任何能向光电池散射的光,对于这类仪器来讲,光电管及灯的稳定性要求比较高,否则会引起较大测量误差。3.1.2双光束滤光片荧光计贝克曼比例荧光计属于此种类型仪器,它是采用一种特殊设计的汞蒸气灯,具有斩光器作用,使样品和标准各接收60 Hz的相同辐射脉冲并为短的暗间隔所分开,从而保持一个恒定的参比水平。这类仪器消除了由于线路电压波动所引起的变化,具有较高的稳定性。

 

　　3.2荧光分光光度计

 

　　3.2.1单光束荧光分光光度计在荧光光谱定量分析中,滤光片式荧光计由于有较高的辐射照到样品上而具有较高的灵敏度,但因它易引起光谱干扰而逐渐被荧光分光光度计所取代。早,单光束荧光分光光度计作为紫外可见分光光度计的一个附件仪器,从光源到探测器只有一束测量光。在测量时,参比和样品交替进行,因而较易引起测量误差。

 

　　3.2.2双单色器单光束荧光分光光度计这类荧光分光光度计是90°角照射样品,结合两个光栅单色器的单光束仪器。它是由氙灯发出激发光,经过激发单色器分出的单色光照射到样品上,然后使发射单色器接收荧光到检测器。

 

　　3.2.3双单色器双光束荧光分光光度计这类仪器将从光源来的辐射在穿过个单色器照射到液池之前分成两路,这可用斩波器或光束分离器来完成。分光后一部分辐射通过液池及第二个单色器照在检测器上,而另一束辐射从液池及第二单色器的侧旁经过照在检测器上。

 

　　如果以斩波器来分光,则可使用一个单独检测器轮流测定来自两光束的辐射;如果使用光束分离器,则需要第二个检测器来测量参比光束的强度。在这两种情况下,荧光光谱都由测得的来自样品的发射强度与作为波长函数的参比光束强度的比值组成。

 

　　FRS_100型荧光分光光度计分别属于上述两种情况。还有一类双光束荧光分光光度计是将从光源辐射的光分为两束,一束通过液池而另一束用作参比。第二束往往要通过一个参比溶液或在测定前作强度衰减,在许多仪器中采用了零点测定法,即利用衰减器将参比光束在检测器上的响应值调节到与样品的发射在检测器上的响应值相同,然后读得衰减器上此时所调定的值,可利用同一检测器交替测量这两光束,或以不同的检测器同时测定。第三类双光束荧光分光光度计是以美国Turner公司生产的210型荧光分光光度计为代表。

 

　　它具有激发光光源和参比灯的两道光束,交替地照射于测量辐射器上,参比灯在固定波长的强度是可变的,由光平衡系统调节参比灯的能量使其与激发光的能量相同,从参比灯发出的另外一束光通过衰减器到达光电倍增管检测器。衰减器是由一个与发射单色器联结的传动轮所驱动,这使得光电倍增管的光谱感应与发射单色器的光谱特性的组合得到补偿,因此交替照射于光电倍增管上的是一束经过校正的能量恒定的光束和一束由试样发射的荧光,在整个扫描的波长范围内记录两道光束在每一波长的比率所得到的曲线就是荧光光谱。

 

　　3.2.4激发和发射均为双单色器的荧光仪Spex公司的Fluorolog_2系列仪器的激发和发射均为双单色器,这种仪器减少了杂散光的干扰,对于生物样品等光散射比较强的样品测定十分有利。这类仪器灵敏度非常高,稳定性十分好。