光片显微镜（LSFM）使用薄层光激发焦面上的荧光分子。它具有真正意义上的光学切片能力，所以可以提供（相对于传统显微镜）更高的轴向分辨率、极低的光漂白和光毒性，并且可达到几十甚至上千帧的帧速。光片显微镜被广泛应用于透明化大样品的深度分析，以及对活体生物样品进行高时空分辨率的3D长时间观察。独立的照明和检测通道是光片技术的配置。片层照明（SPIM）和数字扫描光片（DSLM）是各种光片设计的基础。在这篇综述文章里，作者会谈到光片显微镜的光学设计、技术细节、数据处理考量、应用、局限性以及未来的趋势；会比较不同的样品放置方法，包括自制样品仓、玻片、多孔板等；会讨论光片技术的各种应用，包括脊椎动物和无脊椎动物的胚胎、大脑和心脏研究、3D细胞培养模式、单细胞、组织切片、植物和机体相互作用以及全脑成像等。此外, 还有光片技术和其他成像技术的结合, 从而实现超分辨、提高穿透深度，以及通过光操作达到更多维度的观测等。

理论上光片不会照亮焦面以外的荧光分子，如果需要对复杂3D结构成像或者在3维层面进行动态观察时，光片显微镜的优势体现得明显。

光路设计

光片技术包括至少一支激光、一个照明激发光路、电动载物台、一个垂直于激发光路的成像检测光路、一台高配置的工作站来保存和处理数据。激发光路用于把准直的激光转化为光片。常用的有两种方法：SPIM采用柱面镜产生静态光片；DSLM采用电动控制的振镜高速扫描激光束产生动态光片，因为这种方法可以对光束形状进行实时动态调整，所以绝大多数需要提高光片空间分辨率的设计都采用这种照明方式。检测光路与激发光路垂直，其光路设计跟大多数宽场显微镜的检测光路类似。

光片性质

一个的光片在xy层面上应该尽量长，在z层面上应该尽量薄且均匀。但是受限于物理光学仪器的限制，实际实验中永远不能实现。实际应用中的光片大多是高斯光束（Gaussian Beam），虽然其他的光束比如贝塞尔光束（Bessel Beam）和艾里光束（Airy Beam）也有应用。

光片设计有几个最基本也最重要的参数。一是光腰，也就是光片中心区域的厚度，光腰厚度跟激光波长以及激发物镜的NA值相关。二是光束的有效长度（视野大小），则跟光腰厚度直接关联。三是检测物镜的工作距离，它直接决定了的样品扫描厚度，并和光束长度一起定义了可成像体积。四是横向分辨率，影响横向分辨率的是激发波长以及检测物镜的NA值。五是轴向分辨率，需要根据激发和检测的点扩散函数计算，与两个物镜NA值、激发以及荧光发射波长、溶液折射率都有关系。详细计算公式可参照原文。

照明与检测物镜

照明与检测物镜的设计一般可分为两类：一是基于不同形状样品仓的设计，主要应用是高内涵成像（high content imaging）；一是基于平面样品平台设计，主要应用于高通量成像（high-throughput imaging），样品载体一般是玻片、多孔板等。

基于样品仓的设计大部分使用低到中NA值的空气物镜或者水浸式物镜照明，中高NA值的水浸式物镜用于检测。这种设计一般用于（较）大样品，比如整个胚胎、3D细胞团、3D类器官等进行高内涵成像。大多数设计也会包含旋转载物台，从不同角度对样品成像，以实现xyz三轴同向分辨率，一些设计采用多个照明光路用于提高样品照明的均匀度，还有一些设计使用多个成像光路来增加成像速度和成像深度。

平面样品平台设计包括倒置以及正置光片，样品放在常规或者自定义的玻片、多孔板上，多用于高通量扫描，比如大规模的药物筛选。但是这种设计对于物镜的限制较多，并且样品不能旋转。这种设计也可引入微流控系统，控制样品沿毛细微管移动成像。

倾斜光片(Oblique plane microscope)采用单物镜激发和检测荧光信号。这种设计中光片以一个倾斜角度进入样品。倾斜光片的优势在于可以使用单只高NA物镜（可达1.35）进行激发和成像，并且适配绝大多数常规放样方法。另外一个巨大的优势是光片和物镜焦面校准的稳定性。常规光片会因为温度的变化影响对焦的稳定，但是在倾斜光片中，温度会同时对光片位置和物镜焦面施加相同程度的影响，所以成像相对位置不会变化。也有其他的单物镜光片显微镜引入原子力显微镜悬臂、多模光纤、或者定制光学部件进行成像。

荧光染料

所有常规用于荧光成像的染料或者蛋白都可以被用于光片成像，并且对于一些对光漂白特别敏感的染料，光片会有较大的优势，因为光片显微镜的光毒极低。对于活体成像一般需要内源表达的蛋白，长波段激发比短波段的更适合生物样品，在透明化样品中的散射也会更少。

化学遗传标记指示剂比如SNAP-tags、Halo-Tags，因为必须与感兴趣蛋白结合才能发光，所以一般能消除背景荧光噪音。

样品固定

光片显微镜的样品固定方法多种多样，只要能保持样品3D形态或者活体样品活性即可。大多数高内涵成像的样品固定方法都与传统荧光显微镜固定样品的方法不同。 固定方法必须保证样品在整个空间的可操作性、定位的精准性、以及空间转换的可靠性。另外，样品固定必须尽量减少照明以及检测光移动的距离，所以对于非球形样品，最长轴是沿Y轴（非照明和检测）方向，这也对提高横向分辨率有极大的帮助，并尽可能的增加可成像空间体积。对于各种各样的样品，比如小鼠运动轴突、鼠脑、小鼠器官、斑马鱼、胚胎、植物、人类及小鼠免疫细胞、类器官等，都可以找到开源的样品固定装置和成像步骤说明。

用于发育生物学的斑马鱼和其他大部分昆虫模式动物都是卵生生物，胚胎不需要外部营养供给，所以活体成像时样品大部分固定在低浓度琼脂糖内部或者表面。固定样品的管子可以是玻璃毛细管或者管壁极薄的FEP管。一般多个样品可以被同时固定，用来增加通量或者对比实验。

胎生生物比如老鼠和其他哺乳动物的胚胎更加脆弱，所以样品固定的步骤也更加复杂。植入前的胚胎已经被证明可以在FEP薄膜上稳定的成像。植入后的胚胎对样品固定的挑战更大，但是也有已发表的详细步骤可以参考。原理上，固定样品的上样和上面提到的卵生生物上样差别不大，而活体样品的上样需要无菌环境、以及精确的环境控制，包括温度、湿度、二氧化碳和成像介质等。这些在光片显微镜的设计中都要考虑。并且在实际成像中还有很多其他因素，比如适合样品生长的凝胶一般会吸收和散射光。商品化介质中包含的酚红会降低信噪比等等。

植物样品的上样比较特殊，但是远比不上胚胎上样的复杂性。主要需要考虑的因素包括成像视野是否能涵盖植物生长的空间、重力、生长方向以及光照的影响。

3D成像

光片显微镜成像前一定要经过校准。3D成像过程中，一般通过移动样品，在z轴各个层面拍摄2D图片并合成为3D图片。较大的不透明样品也需要通过移动xy轴进行拼接，或者旋转进行多角度成像。光片本身也可以移动来实现均匀的照明。

光片成像中一个常见的现象是会有较亮或者较暗的条状图案，这是由生物样品上某些特定结构对光的散射或者吸收造成的。可以通过快速旋转照明光（Pivoting），也可通过声光偏转器(acousto-optical deflectors)、全息扩散片(elliptical holographic diffusers)、或者自再现光束（Self-reconstructing beam) 减少对成像的影响。

虽然光片理论上只照亮焦面上的荧光分子，但是样品本身对激发光的散射会造成焦面以外的信号被激发，从而降低图片信噪比。通过结构光照明以及后期重建可以抑制焦面外的噪音并提高图片质量。但是结构光需要对同一样品至少进行3次成像，所以会降低时间分辨率。另外可以利用相机卷帘快门的特性，让入射光扫描和相机卷帘快门同步，从而隔绝焦面外的噪音。并且成像速度基本不会受到影响。

光片也可以与其他成像技术结合满足其他的应用需求，比如拉曼光谱仪、FCS、FLIM、FRAP等。

实验结果

取决于具体的应用，光片结果可能包括多个样品、几百甚至上千个时间点、几十个视野拼接（取决于样品大小）、多个成像角度、达6个荧光通道。每个实验可能有几个TB的原始数据，比传统荧光显微镜高几个量级。所以在建立光片实验之前，整个平台的数据保存、备份、处理、扩展[d1] 和维护都必须事先考虑到。

数据处理和可视化

在实验数据保存结束之后，原始数据必须经过数据处理来纠正技术误差，压缩文件大小，重建复杂的空间定位以及进行可视化，保存备份和分析结果。FIJI是个非常完善的开放平台，并且有各个实验组持续不断地开发插件来进行通用的或者定制的实验分析方案。

常规的预处理包括矫正热像素(hot pixels)/死像素(dead pixels)，扣除背景，无损/有损压缩，系统化的文件命名等。

大样品或者透明样品需要高效、精确、并且可扩展的图像拼接重建完整的3D样品。多侧/多角度成像的样品需要采用基于图像的变换矩阵或者基于兴趣点的图片配准和对齐进行融合。反卷积是有效的提高信噪比的手段。这些处理方法可以结和起来使用，并且现在也有成熟的开源配套插件。其他进一步的矫正和调整方法包括样品位置偏移矫正、球面相差和色差矫正、光漂白矫正等。

渲染工具是个可以对处理之后图片进行可视化的有效手段。这些渲染工具允许用户对样品图像进行任意角度的观察，任意位置的切割，并且对于复杂的样品形态能通过表面渲染、阴影高亮或者透明化处理等手段让观察更直观明显。

使用常规电脑进行光片数据的处理一般都不可行，因为图片大小很有可能超过内存的大小。一些开源插件比如 BigDataViewer采用ImgLib2通过虚拟数据和缓存可以避免这种问题。BigStitcher插件可以进行上面提到的绝大部分处理步骤。其他可以处理光片数据的插件或者开源软件包括 Vaa3D、TeraStitcher等。

ClearVolume插件可以在实验期间实时检查图片。其他可视化或者渲染插件包括3Dscript（创建动画）、TeraFly（Vaa3D和Scenery的插件）可以使用VR头显进行互动式的观察。BigVolumeViewer可以进行不限大小的数据渲染。UCSF Chimera也可以用来进行光片数据的可视化。除了开源软件/插件, 也有不少商品化软件提供了友好的操作界面和对现有商业光片显微镜文件的兼容。