大体解剖组织透明化的概念在一个多世纪前就被提出了, 但是直到最近才在显微成像领域开始流行。随着现代光学物理和化学应用的发展，尤其对大样品进行单细胞分辨率成像的显微技术不断成熟, 以及能对超大数据进行保存和分析的计算资源的涌现，他们共同驱动了大组织透明化这个概念的复兴。由于对生物结构和功能之间关联的研究一般都需要三维成像, 所以组织透明化有很大潜力解锁很多生物科学新发现。但是, 目前有关这方面的文献相对复杂, 让新入门的研究人员望而却步。
本篇由光片专家郑超主要根据Alba Vieites-Prado and Nicolas Renier的综述“Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology”和其它透明化文献进行编译整理总结。目的是勾勒出透明化研究的模块框架, 使得对透明化感兴趣的研究人员有能力开发针对自己应用的透明化方法。另外, 也会提到大规模透明化需要的成像和计算资源, 概述目前透明化技术的主要应用, 并对透明化技术目前的局限性以及以后的发展前景做简单的讨论。
应 用
在常规切片以外， 透明化为大生物样品的分析提供了一个非常好的途径。相比于切片，透明化一般在制样时费时更久，因为需要在不同的溶液中培养并染色。但是这些过程一般不需要太多的人工干预， 也不需要复杂的专业技能。透明化也不需要类似于切片机之类的专业工具， 并且支持大规模并行处理。最重要的是， 组织透明化杜绝了对样品的机械损伤，并且对计算资源的需求相对于复杂的切片重组要简单很多。对于密集的样品， 透明化可以提供更精确的计算结果。最后，透明化也可以完成传统切片无法完成的一些应用，比如对跨越整个器官或者组织的追踪（比如长距离神经追踪，癌症转移路径等）。
生物应用层面，透明化的应用也是非常广泛。主要的应用集中在神经科学，肿瘤学和心血管学。噬齿类动物几乎每个器官包括脑、肠、脾、淋巴结、心、肾、肺、眼和骨等都已经被透明化了 。其他模式动物和非模式动物包括鱼和蝾螈等也都已经被透明化。体外模型包括3D细胞球体和类器官等的尺寸也一直在增大（几个毫米的直径）也需要组织透明化来进行完整的3D观察。最后，透明化以及相关的成像技术也越来越成熟。
神经科学应用
包括老鼠和人在内的很多生物中，神经都是身体的细胞， 最长可以到几个厘米。这个尺寸决定了要研究它们就必须对整个器官甚至生物体进行研究，可以通过切片或者透明化。神经系统组织富含脂质， 色素和胞体外蛋白，比如胶原蛋白和弹性蛋白，因其含量很低， 所以极为适合透明化，去脂之后就只剩下稀疏的蛋白结构了。水基和基于有机溶剂的透明化方案都已经被证明可以对神经系统进行透明化，不过对于高脂密度区域结合两种方法同时使用， 比如脊髓和大脑中的有髓轴突。
神经科学研究的主要目标是剖析完整的大脑接线图，这个领域被称为连接组学。即使在透明化之后，神经元的密度依然会超过荧光显微镜的分辨率极限， 常见的做法是通过稀疏标记的神经元集合来创建区域投影， 包括在细胞类型特异性启动子控制下的基因编码荧光蛋白和用特定细胞类型的已知标记物进行免疫标记。荧光蛋白的表达可能涉及每种细胞类型的单一荧光蛋白，可能使用多种荧光蛋白的组合表达，以便能够识别数百个单个细胞（例如Brainbow和其他类似方法）。荧光蛋白的表达可以通过转基因或者携带荧光蛋白编码DNA的病毒来实现。狂犬病毒和腺相关病毒（AAV）通常用于转导神经系统的细胞：例如，将AAV载体的组合直接注射到小鼠的大脑中，以确定中脑多巴胺神经元的支配模式。一个创伤性较小的方法是使用AAV载体，它可以被注射到血液中并感染大脑的特定细胞类型。为了帮助分析透明化组织中的稀疏标记的神经元，已经开发了空间神经元追踪算法，可以进行手动或半自动的分割。的全自动算法，如NeuroGPS-Tree，在厚的透明化组织切片中追踪了1000多个神经元，还有一个称为BIRDS的软件，它使用深度学习来进行长距离的神经元投影追踪和不同脑区的细胞群的平行计数。
组织透明化也被用来绘制生物体执行某种行为或受到某种刺激后的大脑活动区域。大脑活动可以通过免疫染色激发基因的蛋白质产物来推断，如Fos。如果Fos出现在一个神经元中，这表明它最近被激活。使用这种方法，通过感知刺激或者观察小鼠的养育行为，在透明化大脑中完成了脑区活动图谱的绘制。
最后，组织透明化显示了帮助神经相关病理研究的潜力。最近，SWITCH透明化和免疫标记方法用来研究可以导致阿尔茨海默症发病和发展的amyloid-β（Aβ）肽在全脑范围的标记和成像。这种方法允许对Aβ斑块进行微观测绘，并确定了几个新的皮层下Aβ积累的中心。
迄今为止，大脑透明化主要集中在啮齿动物组织上，因为人类组织的几个问题：较强的自发荧光、长期保存造成的过度固定和较大的物理尺寸。最近，更新过的SHANEL和ELAST透明化协议可以对人类全脑进行透明化。在这一领域存在许多令人兴奋的应用。
使用CUBIC或vDISCO技术进行全动物透明化，能够以单细胞分辨率观察整个啮齿动物的微转移灶。此外，通过对治疗性抗体进行荧光标记，可以检测整个动物体内接受治疗的转移部位的百分比。
在癌症病理学领域，人们对三维样本是否比传统的二维手术取样技术提供更准确的诊断或预后感兴趣。一种被称为ExPATH（expansion microscopy）的技术，对乳腺癌患者的透明化活检样本进行成像，能够比手术取样更好地区分早期乳腺肿瘤性病灶。PathoDISCO可以在不到48小时内对手术切除的大型（30 × 20 × 5毫米）乳腺肿瘤样品进行透明化；PathoDISCO的关键步骤是使用2，2-二甲氧基丙烷与水反应生成丙酮和甲醇，迅速使组织脱水。
围绕组织的微环境是高度异质性的，并影响其生长和发展。水凝胶包埋协议已被证明可以保留发育中乳腺组织周围微环境的重要元素，并对其进行三维研究。通过这种方式，CUBIC组织透明化方法通过对实验性肺转移小鼠模型中的多细胞相互作用进行分析，揭示了TGFβ在肿瘤微环境中的作用。
对新型非脂质纳米颗粒的研究显示，基于溶剂的和水基的透明化技术都允许这些纳米颗粒在组织中保留，这些纳米颗粒是潜在的治疗剂递送载体。这些研究表明，组织透明化可用于测量新型癌症治疗药物的生物分布。
血管在通过灌注标记试剂进行透明化之前很容易被标记。目前使用过的标记包括针对排列在血管上的目标分子抗体、小麦胚芽凝集素和埃文斯蓝，或亲脂性染料。重要的是，任何染色标记都必须包含能与固定剂（如PFA）反应的分子，否则会在随后的透明化过程中被洗掉。
组织透明化可以研究全身任何器官在发育过程中或受伤后的血管修复和重塑；特别令人感兴趣的是在动脉瘤和中风的情况下对大脑血管破裂以及对心肌梗塞的研究。现在，心血管研究得到了一些半自动的血管分割技术的帮助，这些技术已经在商业和定制软件中开发出来，用于分析透明化小鼠大脑中的感兴趣区域。但是这些方法不足以可靠地检测不同脑区不同信噪比的毛细血管，也不足以在全脑或器官水平上系统地分析血管的改变。基于机器学习的策略克服了这些障碍，目前有两种基于机器学习的方法（VesSAP和TubeMap）可用于可靠地检测、分割并与标记全脑血管的Allen脑图谱进行比对。最近，组织透明化也被用于绘制控制小鼠心率的副交感和交感神经回路，产生大鼠内在心脏神经系统的单神经元尺度图，并量化小鼠心肌梗塞后的交感神经过度支配。
基因组修饰技术，如CRISPR，已经使生物研究超越了传统模式。透明化协议必须适应每个物种，因为许多物种在其整个组织中表达的色素，这些色素有助于保护它们免受危险的紫外线辐射（如鱼类的黑色素对造血细胞龛的保护）。许多色素，如黑色素、眼色素和蝶呤，对过氧化氢漂白有抵抗力，在氨基醇中不能与血红素一起洗脱。DEEP-Clear方法显示，结合过氧化氢、THEED和丙酮可以漂白或去除环带动物、软体动物、多骨鱼和四足动物的大部分色素。其他研究表明，增加脱钙和漂白的步骤可以使甲壳类动物变得清晰，并可以建立具有单细胞分辨率的发育图谱。最后，在为扁形动物定制的组织透明化方案中加入了胶原酶的酶处理，显示了甲状腺素参与了它们在蜕变过程中的眼睛迁移。植物外壁带来了额外的RI失配，这是哺乳动物组织所不具备的，必须加以解决。此外，叶绿体作为一种色素吸收蓝光和红光，并在成像时产生荧光， 这可能对实验有帮助， 也可能破坏整个实验。在一开始使用氢氧化钠和的单一溶液对植物组织进行透明化，该溶液可分解细胞壁并平衡整个样品的RI。尿素、粉、脱氧胆酸钠和NaClO已被用作的低毒替代品。有趣的是，RI匹配的一般原理现在被用来制造透明的木材，甚至有可能取代玻璃作为建筑材料。与二维组织病理学调查相比，临床样本的三维成像可能具有额外的诊断潜力；然而，由于过度固定、高水平的自发荧光、需要外源性荧光标签以及老年患者组织的整体高密度，人类组织样本的成像是比较困难的。对于非常密集的组织，常规较薄的病理组织切片可以通过Expansion Microscopy来改善。对于较大的样品--包括完整的人体器官--需要使用相对较小的洗涤剂（CHAPS）和溶剂分子进行脱脂，以克服人体组织的密度。当组织被拉伸时，弹性化的人体组织可以改善探针的传递效率，同时可以使样品更好地被长时保存，以便进行多轮染色。相反，人类胚胎和胎儿组织的密度较小，更容易进行透明化。基于溶剂的透明化方法已被用于透明人类胚胎和6-14孕周的胎儿。组织透明化已成为对3D细胞团和类器官整体成像的必要条件，因为传统的光镜不能对深度超过100-200微米的部位进行成像。即使是最小的有机体（在50-100微米的范围内）也能从简单的RI匹配中受益。类似大小的人类气道、结肠、肾脏、肝脏和乳腺肿瘤以及小鼠乳腺类器官已经在高浓度的糖溶液中通过简单的RI匹配被透明化。对于更大和更密集的类器官，如三维神经球（直径200-300μm）和视网膜类器官，需要更复杂的组织透明化方法。最后，对于直径达数毫米的类器官，SCOUT方法可以用于透明化、标记、成像以及矫正关联对照组和实验组样品的数百种表型。SCOUT能够在单细胞水平上确定寨卡病毒感染对直径约2毫米的大脑类器官的影响。虽然不是本文的重点，但研究人员已经证明了透明化可以增加几种光学技术在在体样品的成像深度，包括单光子和多光子、二次谐波（SHG）和光学相干断层扫描（OCT）。迄今为止，在体方法主要使用具有生物相容性的高折射率溶液在对皮肤、颅骨和浅表肿瘤的应用，以增加动物和人类系统的成像深度。由于不能使用基因修饰，活体组织的荧光标记可能很困难，所以人类样本经常通过无标签技术成像，如SHG和OCT。在体内进行深度、无标签成像的能力是令人感兴趣的，因为它可能在诊断和了解某些病症（如肿瘤生物学）方面具有临床潜力。系统生物学通常需要对一个组织内的数百到数千个目标进行分析。通常情况下，荧光标记是瓶颈，因为需要耗费大量的时间，所以较小的样本上进行系统生物学研究更为实际。组织透明化可以用于这种较小的样品，例如，空间转录组技术， 如MER-FISH和seqFISH使用成像技术来检测样品中的数千种mRNA，而组织透明化已经与这些技术一起被采用来实现三维空间转录组学。将组织透明化与MER-FISH技术结合起来，就可以读出组织样品中每个细胞中成千上万的mRNA分子的三维位置。透明化技术有一些突出的局限性。首先，透明化常应用于固定组织，在体组织的应用非常有限。其次，还有很多限制透明化样品通量的因素，如透明化设备的样品容量有限，抗体和溶液的成本较高，免疫标记所需时间长，缺乏抗体结合的普遍条件，成像设备的样品容量限制，以及数据存储和分析的IT架构限制等。第三，大型样品的成像需要具有同样大的工作距离的显微镜物镜。大多数为透明化设计的成像系统使用中数值孔径、低倍率、长工作距离的物镜。一般来说，增加物镜的工作距离会降低其数值孔径，从而降低其可实现的分辨率。最后，现在可以透明化的样品的尺寸超过了显微镜下能够容纳的样品尺寸。在对人体器官的研究能够实现之前，必须开发出能够容纳这种尺寸样本的成像设备。值得注意的是，每个组织都是不同的，研究人员不应自动遵循以前公布的方法；例如，透明大脑等高脂质含量组织的方案对色素、蛋白质丰富的肾脏组织并不是方案。在过去的十年里，组织透明化方法有了巨大的创新。现在水基和溶剂基的透明化技术都能保留荧光蛋白和染料的激发，最终透明化溶液的折射率大部分都在1.52-1.56之间的理想RI上。商用化的整套系统市面上也有很多。尽管前景看好，但障碍确实存在。不是所有的样品都可以使用基因编码的荧光蛋白，在许多系统中仍然必须使用免疫标记技术。无论抗体渗透的速度多快，如果抗体不具有特异性或稳定性，最终结果都是一个失败的实验。此外，目前各个抗体的理想标记条件有很大差异，使得研究人员不可能在相同的条件下让整个探针组都发挥作用。我们希望纳米抗体能够解决抗体的许多变异性和稳定性问题，尽管它们也不是没有限制。首先，随机附着在纳米抗体上的荧光团可能会阻断其结合部位，这就需要用基因编码的电击化学方法来定向附着荧光团。第二，由于纳米抗体体积小，可以附着的荧光团比抗体少，提供的信号更弱。第三，纳米抗体主要是单克隆的，可以直接与荧光染料结合。因此，不能使用通常会产生大量荧光信号放大的多克隆二级抗体。在单分子RNA FISH领域广泛使用的放大策略，如SABER和HCR，可以使用纳米抗体。单链可变片段（scFvs）--比纳米抗体更快地穿透生物组织的小型免疫标记--迄今在组织清除方面的应用很少，但可能是一种有前途的标记大型样品的技术。随着组织透明化实验的普及，更深层的生物发现将随之而来。没有任何生物学领域不会从研究组织所有成分之间的三维关系中受益。最近对整个恒河猴和人类大脑的透明化表明，透明化方法正在超越成像技术。希望在这种规模上成像的实验室将需要与工业界合作，设计和制造工作距离为几十厘米的物镜和光学系统，并且依然具备合理的横向和轴向分辨率。毫无疑问，组织透明化的普及已经开始， 并且前景无比广阔。
