食物中的测定--荧光分光光度法

食物中的测定--荧光分光光度法
1.原理
食物中蛋白质在酸水解过程中，其极易被分解，本法用碱水解蛋白质，直接测定的天然荧光。在蛋白质水解液中，只有和可以检测到荧光。在pH为11时，的荧光强度比大100倍，且两种氨基酸的荧光峰相差40多nm，利用此特点，可在有大量的存在下，检测的含量。
2.适用范围
参照中国预防医学营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版。适用于食物中的测定。
3.仪器
3.1荧光分光光度计
3.2减压蒸发器
3.3螺旋盖大口瓶（瓶盖要有橡皮垫）
3.4聚四氟乙烯管
3.5小玻璃球
3.6烘箱
4.试剂
（1）5mol/L NaOH：内含0.5%可溶性淀粉，临用前配制。
（2）4mol/L 尿素（pH=11）
（3） 6mol/L盐酸
（4） 溴百里酚蓝指示剂：称取0.1g溴百里酚蓝加0.1mol/L1.6ml，配成0.05%水溶液。
（5） 高纯氮（含量99.999%）
（6） 辛醇甲苯溶液：内含1%辛醇
（7） 标准液：（1mg/ml）：称取标准，用0.005mol/L的溶液溶解，贮存于冰箱保存。
5.操作步骤
5.1称取含粗蛋白质约5mg的食物样品，置于聚四氟乙烯管中，加含可溶性淀粉的5mol/L1ml，加入1滴辛醇。
5.2将各管分别盖上小玻璃球，放入1只带螺旋盖的大口玻璃瓶中，将瓶置于减压蒸发装置中，加冰和盐降温，减压至真空度1.3Kpa10mmHg以下，继续保持15min，充氮气再减压，如此反复3次，迅速旋紧大口瓶的螺旋盖。
5.3将充氮气的大口瓶置于烤箱内，在110℃水解样品22小时。
5.4冷却大口瓶，用重蒸馏水将样品分别洗至25ml容量瓶中，（内含6N Hcl0.7ml）用溴百里酚蓝为指示剂调pH至中性，用重蒸水定容至刻度。
5.5吸取样品液1ml，于10ml带盖试管内，用pH11的4mol/L尿素溶液稀释至刻度，在激发波长为280nm，发射波长为360mm下测定荧光强度，根据标准的荧光强度曲线，计算样品中含量。
5.6标准曲线：用前将标准贮备液稀释成每ml含100，200，300，400μg的标准系列。取每种浓度的标准液各1ml（双份）与样品管同样加试剂，同时水解，以标准浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。
6.计算
每100g样品中的含量（mg）=
A×D×100
1000×W
式中
A：根据标准曲线得到的每ml测定液中的含量（mg）
D： 稀释倍数
W： 取样量（克）