弱极性色谱柱在反相色谱中用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。
样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18、C8、C4、C6H5等。
随着色谱柱的保护柱长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。保留时间的变化指两种类型的情况，一种是同一根柱样品间的保留变化，第二种类型主要是填料的差异造成的，许多实验都会碰到。
不同牌号的色谱柱分离的色谱峰保留时间可在小范围内移动，但峰的顺序和分辨率不变，可改变流速或溶剂强度(反相色谱加水调节)进行校正。如果谱图中色谱顺序发生了变化，或者两峰重叠在一起，问题就比较严重。保留时间发生大的变化，主要由柱填料硅酸相互作用所致，另外有次级保留因素的影响。硅胶为基质的填料表面含有硅醇，有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅胶表面硅醇基更多。酸性或碱性分子可与硅醇发生不同程度的相互作用。硅酸与样品分子作用的强弱，因不同批号的硅胶和不键合相填料而异。即使同批号的硅胶而不同批号的键合相也有差异。硅醇对阳离子或碱性样品影响大。
