弓形虫是一种专性细胞内寄生原生动物。 它没有特定宿主，几乎可以感染所有动物，包括人体内的各种有核细胞。 人和动物的感染率都很高。 当猪弓形虫病爆发时，可使整个猪场患病，病死率高达60%，造成巨大的经济损失，严重影响养殖业的发展。 猪弓形虫病与公共卫生密切相关。 猪肉是人们生活中最重要的动物源性食品。 感染弓形虫的猪及其肉制品是人类感染弓形虫的重要传染源，对人类健康构成极大威胁。 威胁。

1 病原学特点

1908年，病原体弓形虫在北非突尼斯被尼科尔和啮齿动物梳趾鼠发现，并正式命名。 弓形虫（gondii，T.gondii）简称弓形虫，属于顶复门（）、孢子虫门（）、真球虫门（）、肉孢子虫门（）、弓形虫门（）。 目前多数学者认为弓形虫只有一种、一种血清型，但存在不同的毒株。

弓形虫的有性繁殖发生在最终宿主猫的小肠上皮细胞中，无性繁殖发生在中间宿主温血动物除红细胞之外的有核细胞中。 弓形虫的整个发育过程一般包括滋养体（又称速殖子）、包囊、裂殖体、配子体和卵囊五种形态，分别在中间宿主和终末宿主中完成。 速殖子呈弓形、新月形或香蕉形，一端尖，另一端钝圆形，平均尺寸为（4-7）μm×（2-4）μm。 猫身上有卵囊，呈椭圆形，大小为（11-14）μm×（7-11）μm。 囊肿呈卵圆形或椭圆形，直径5～100μm。

猫吞下弓形虫的包囊或卵囊，寄生虫就会被释放出来。 有些寄生虫通过淋巴和血液循环携带到全身各个器官和组织，并侵入有核细胞。 蠕虫发育的裂殖和配子发生，产生卵囊。 卵囊随粪便排出体外，在外界发育成具有传染性的孢子卵囊。 中间宿主进食或饮用被孢子卵囊污染的食物和水后，孢子卵囊释放出子孢子，通过淋巴液和血液进入组织器官，侵入有核细胞形成感染。 如果感染毒株的毒力很强，而宿主又不能产生足够的免疫力，就会引起弓形虫病的急性发作； 反之，如果菌株毒力较弱，宿主能很快产生免疫力，寄生虫转入缓殖子阶段，在包囊内缓慢增殖，形成持续性感染。

2 流行病学特征

弓形体病是一种世界范围内流行的人畜共患病，动物和人类的感染十分常见，至少有200种哺乳动物被感染。 主要传染源是病人、病畜和带寄生虫的动物。 弓形虫可能存在于血液、肉类和内脏中。 母乳、唾液、痰液、尿液和鼻腔分泌物中含有弓形虫； 流产胎儿体内、胎盘、羊水中存在大量弓形虫。 该病的感染率没有严格的地区和季节分布，但以秋、冬季和早春发病率，可能与动物机体抵抗力有关。 每年约有十亿人感染弓形体病。 感染率与当地居民的文化、饮食习惯有关。 外来人群感染率为0.6%至94%，平均为25%至58%。 弓形虫感染率较高，以法国，感染率达80%~90%； 荷兰人口感染率也很高，达到40%； 非洲和拉丁美洲的感染率也很高； 美洲和大洋洲的感染率较低。 我国弓形虫的发现在亚洲较早。 新中国成立前，我国尚无弓形虫病的报道。 1964年，谢天华在江西报告人类弓形虫病。 我国几乎每个省份都有人类弓形虫病的报告。 感染率从0.09%到34%不等，平均感染率为7.88%。 各年龄段人群均可感染，少数民族地区感染率可能较高。 弓形虫感染率低于世界平均水平，但呈逐年上升趋势。

弓形虫在家畜中十分流行，猪、羊、牛、马等均可感染，其中以猪为害严重。 据国外报道，该病多发生于3～4月龄仔猪，其症状与猪瘟相似。 病死率可高达30%～40%，其中乳猪病死率，成年猪发病较少，多为隐性感染或症状较轻。 1955年，于恩树等人首先在福建从猫、猪等动物体内分离到弓形虫。 1977年，吴硕贤从上海“不明高烧”猪体内分离出弓形虫，证明我国存在猪弓形虫病暴发。 我国弓形虫感染率为4%～71.4%。 不同品种、年龄和性别的猪都可能受到影响。 7～9个月龄时发病较多。 25公斤以上育肥猪发病率。 其发生率没有一定的规律性，但性别差异较大。 母猪感染率为36.4%，公猪感染率为29.4%。 按流行形式可分为暴发性、急性、散发性和隐性感染。

弓形虫感染在我国其他动物中也很常见。 猫的感染率为15%-73%，狗的感染率为3%-33%，羊的感染率为10%-50%，牛的感染率为0.2%。 %~43.3%。 家禽也感染弓形虫。 鸡、鸭、鹅的感染率分别为15.69%、3.84%、16.54%。

3 危害

弓形虫感染通常作为隐性感染发生在免疫力正常的人群中，一般没有明显的临床症状。 一旦机体免疫力减弱或免疫功能缺陷被感染，就会引起全身反应和多器官损害，严重时甚至死亡。 怀孕期间感染弓形虫可导致流产、早产和死产。 弓形虫可通过胎盘感染胎儿，造成胎儿先天性感染。 胎儿出生后出现一系列中枢神经系统症状以及眼睛和内脏先天性损伤。 有些新生儿出生时没有特殊体征，仅表现出体重低、贫血、黄疸等，但逐渐出现抽搐、脑膜炎、癫痫等神经系统疾病，可造成智力低下。

动物感染弓形虫后，生长缓慢，饲料利用率下降，生产性能低下，长期侵染，严重时死亡； 造成种产异常、流产、死产，造成严重的经济损失。 其中，以猪为害严重。 目前，猪弓形虫病在我国分布广泛，华北、华东、东北、华中、华南、西南、西北等地区均有该病发生的报道，且感染率较高。并且死亡率普遍较高。 猪肉是人们生活中最重要的动物源性食品。 感染弓形虫的猪及其肉制品对人类健康构成极大威胁。 感染弓形虫的猪通常没有明显的临床症状，但实际上，亚临床感染猪的组织中可能含有弓形虫包囊。 可能引起人类弓形虫感染。

利用PCR技术对加工后的猪肉香肠样品进行扩增，同时利用加工后的猪肉香肠样品进行小鼠动物实验，利用IFA检测小鼠血清中特异性抗弓形虫抗体，PCR检出率47.14%。 (33/70)，小鼠血清呈阴性。 虽然结果显示猪肉香肠样品中不含有活弓形虫，但PCR的高检出率也表明猪肉香肠受到弓形虫污染严重。 如果香肠在加工过程中食盐浓度低于3.0%且腌制时间少于3天，就不能有效杀灭香肠中的弓形虫包囊或速殖子。 1997年韩国爆发2起食源性急性弓形虫病，共8人，均因食用未加热的（野）猪的脾脏和肝脏所致。 迪亚斯等人。 等对巴西隆德里纳的47份屠宰工人血清和149份（8家厂家）新鲜猪肉香肠进行小鼠生物学检测，发现血清阳性率分别为59.6%（28/47）和8.7%（13）。 /149），表明新鲜猪肉香肠在弓形虫病的传播中发挥着重要作用。

4 诊断技术

根据临床症状、病理变化和流行病学进行初步诊断。 为了确诊，必须在实验室检测病原体或特异性抗体。 主要方法原学检查、血清学检测、分子生物学诊断等。

4.1病原学检查

4.1.1 直接涂片

取血液、血清、腹水或肝、肺、淋巴结等病变材料进行吉姆萨或瑞氏染色涂片染色，镜检。 如果发现寄生虫，即可确诊。 该方法诊断弓形虫病非常准确，但检出率较低，且容易漏诊。

4.1.2 组织切片染色

病灶组织冰冻切片、免疫酶或荧光染色不仅可以对包囊进行染色，还可以对感染细胞内散在的弓形虫速殖子和蠕虫进行染色。 该方法灵敏度高、特异性强，可提高蠕虫病毒的检出率。

4.1.3 动物接种分离方法和细胞培养方法

将肝、肺、淋巴结等病材匀浆，加5-10倍生理盐水，混匀，过滤，离心，取上清液接种于易感动物及小鼠腹腔内，观察发病情况，即可盲目地传了好几代。 以提高检出率。 该方法灵敏度和特异性强，但耗时长。 上述病材也可接种于体外培养的单层有核细胞中。 与动物接种相比，细胞培养的敏感性较低，但所需时间较短。

4.1.4 卵囊检查方法

用饱和氯化钠或蔗糖溶液（30%）漂浮粪便，收集卵囊进行镜检，但检出率一般较低。

4.2 血清学检测

血清学检测因其快速、准确、经济等优点，已成为广泛应用且发展迅速的弓形虫感染检测方法。 主要方法有：染色试验、间接红细胞凝集试验、ELISA、间接免疫荧光试验、补体结合试验和免疫胶体金技术等。

4.2.1 染色试验（DT）

弓形虫速殖子、补体辅助因子和待测血清于37℃孵育1小时，然后用染色。 当特异性抗体存在时，虫体膜通透性增加，细胞质流出，速殖子不能与染料结合，呈无色； 当没有特异性抗体时，速殖子可以吸收染料并呈现蓝色。 该方法是弓形虫病的经典血清学检测方法，具有良好的特异性、敏感性和重复性。 但由于检查时必须使用活的、剧毒的速殖子，该方法受到一定的限制，存在巨大的风险。

4.2.2 间接血凝试验（IHAT）

速殖子可溶性抗原吸附在红细胞表面，然后与相应的抗体发生反应，通过抗原与抗体的特异性反应，间接凝集红细胞。 1957年Jacob和Lunde首先将此方法应用于弓形虫病的检测。我国于恩树于1979年将IHAT应用于猪弓形虫病的检测。1982年中国农业兰州兽医研究所研制出IHAT诊断仪成套工具。 威尔逊等人。 利用ELISA、IHAT和IFAT试剂盒检测100份血清样本，得出IHAT在急性感染早期对血清缺乏敏感性的结论。 崔兆军等. 认为IHAT特异性高、假阳性率低、诊断价值高、操作简单。 缺点是灵敏度不如ELISA，重复性差，致敏红细胞不稳定，阳性判断标准具有一定的主观性。

4.2.3 酶联免疫吸附试验

将ELISA板涂上速殖子可溶性抗原，加入待测血清，然后滴加酶标二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗羊IgG），利用酶的催化作用和扩增反应底物的原理是对待测抗体进行定性和定量分析。 1976 年，Voller 等人。 将该方法应用于弓形虫特异性抗原的检测，与DT、IHAT获得了良好的符合率，且灵敏度强。 Peter等人用弓形虫bold抗原建立了间接ELISA检测猪弓形虫病，并与DT法进行了比较。 结果表明，间接ELISA的敏感性和特异性均为94%。

近年来，随着分子生物学技术的应用，重组抗原已取代天然抗原作为诊断抗原，省去了抗原制备的繁琐过程，从而达到经济、特异、安全的目的。 雷德利希等人。 利用表达的融合蛋白GRA6-GST建立ELISA，灵敏度为98%； 奥伯特等人。 混合重组杆状蛋白1（ROP1）和表面抗原蛋白（P25和P35）建立弓形虫ELISA检测IgM，灵敏度、特异性和符合率分别为93.1%、95.0%和94.5%，可用于弓形虫的早期诊断； 黄等人。 建立了表面蛋白P22（SAG2）的ELISA方法，与IHAT进行比较，发现该方法特异性强、灵敏度高。 在中国，Lu Bin 等人。 建立了重组 P35-GST 检测人血清中 IgM 的 ELISA 方法。 此方法可区分弓形虫病的急性感染和慢性感染。 张东林等. 建立了可检测多种动物体内弓形虫抗体的AG-ELISA，并在人工感染猪和自然感染的4种动物（猪、牛、猫、狗）的血清中检测到抗弓形虫抗体，表明AG- ELISA法的阳性检测时间早于改进的凝集试验方法，其检出率、灵敏度和准确度均优于乳胶凝集试验。

综上所述，该方法易于自动化，具有较高的特异性和灵敏度，结果可量化。 适用于批量样品的检测，具有良好的推广应用价值。

4.2.4 间接荧光抗体试验（IFAT）

以速殖子为抗原，与待测稀释血清孵育，加入荧光素（异硫氰酸荧光素）标记二抗，荧光显微镜下观察结果。 米勒等人。 用该方法对免疫组化和病原学分离的28例阳性病例和46例阴性病例的血清进行检测，发现敏感性和特异性分别为96.4%和67.3%。 该方法用于检测弓形虫感染早期的IgM和IgG抗体，具有灵敏度高、特异性强、重现性好的优点，但类风湿因子可引起IgM抗体的假阳性反应。 由于需要荧光显微镜观察，该方法的广泛使用受到限制。

4.2.5 免疫胶体金技术（ICT）

ICT是一种新型免疫标记技术，利用胶体金作为示踪标记物应用于抗原和抗体。 王艳华等. 建立ICT检测弓形虫血清并与IHAT进行比较。 结果一致率为82.5%。 ICT比IHAT早2天检测出弓形虫抗体，表明ICT比IHAT更敏感。 日本带广动物科技大学建立了一种快速免疫色谱法，利用重组 SAG2 抗原检测猫体内的弓形虫抗体。 结果证明ICT具有快速、简便、灵敏（灵敏度可达到ELISA水平）和特异性，是现场诊断弓形虫特异性抗体的有效工具。

4.2.6 乳胶凝集试验（LAT）

在以乳胶颗粒为载体的凝集反应中，于恩树等人指出，LAT对于检测弓形虫感染初期具有良好的敏感性。 陈亚棠等认为，LAT具有操作简单、采血量少、结果稳定易观察等优点，适合大规模血清流行病学调查。 伦敦公共卫生实验室使用LAT作为常规筛查测试，假阳性率为1%至2%。 江涛采用重组弓形虫微线菌素3（rMIC3-LAT）乳胶凝集试验检测人工感染弓形虫的猪血清中特异性抗体的动态变化。 同时，与IHAT和ELISA相比，发现LAT的灵敏度高于IHAT，抗体的检测时间早于ELISA，检测的时间范围更宽。

总之，LAT具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简单、结果易于判断等特点，可用于早期诊断和抗体监测，适合现场检测和大规模血清流行病学检测。调查。 但该判断存在一定的主观因素，无法定量分析。

4.2.7 补体结合试验（CFT）

尼古拉和罗维洛首先应用该测试来诊断弓形虫病。 认为它是检测弓形虫感染的可靠指标，特别是在检测个体样本时，如果CFT结合IgM或IgA抗体水平或结合亲和性IgG抗体水平可以更客观地反映病程。 该测试不适用于某些动物，例如牛和山羊。

4.3 分子诊断

目前，国内外已建立多种弓形虫病基因诊断方法，主要包括PCR和DNA探针技术，具有操作简单、快速、特异和灵敏等优点。

4.3.1 PCR

PCR检测所用的靶基因主要包括B1基因、P30（SAG1）基因、ITS1、rDNA（18S rRNA和5.8S rRNA）和529bp重复序列。 B1基因是多拷贝基因，序列高度保守，是目前检测的基因。 伯格等人。 1989年采用B1基因作为PCR的靶基因，成功地从细胞裂解液中仅检测出1株弓形虫； 检测血清IgM进行​​对比，PCR阳性检测时间早于ELISA，可用于弓形体病的早期诊断。 谢德华等利用弓形虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS1)序列建立了猪弓形虫病特异性PCR诊断方法。 原生动物和线虫之间不存在交叉反应。 于丽等人。 以529bp重复序列为靶基因建立猪肉PCR检测方法，每10g猪肉可检测100个速殖子，B1基因每10g猪肉可检测1000个速殖子，其灵敏度是B1基因的10倍。 次。

为了提高检测的敏感性和特异性，在普通PCR的基础上发展了巢式PCR、巢式PCR、RT-PCR等。 等人。 基于SAG1基因设计了两对引物，首先使用DS29和DS30引物对进行扩增，然后使用DS38和DS39引物对进行第二次扩增。 灵敏度可达0.05pg弓形虫DNA。 陈晓光等. 建立巢式PCR，最少可检测1pg弓形虫DNA； 泽等人。 使用巢式PCR检测到0.05pg的P30DNA，理论上相当于速殖子的基因组DNA； Ana Hurtado 等人建立的单管。 巢式PCR检测方法，得到的结果与IFAT得到的结果基本一致，灵敏度达到0.1pg弓形虫RH株DNA。

4.3.2 环介导等温扩增（LAMP）

LAMP是Notomi等人报道的一种新型核酸扩增技术。 2000年，它使用BstDNA聚合酶进行自动链循环，而不是经典的DNA合成。 LAMP只需在等温条件（63-65°C）下合成10-20μg DNA，时间为30-60分钟。 与PCR相比，不需要染色，肉眼即可观察结果。 杨秋林等。 我们根据弓形虫特异性基因B1的基因序列，设计了一套LAMP特异性引物，测试表现出良好的特异性和敏感性。 张等人。 利用弓形虫529bp高度保守的重复序列设计LAMP引物，灵敏度为85.7%，而PCR灵敏度为76.9%。 利用弓形虫单拷贝基因SAG1设计LAMP引物，扩增弓形虫DNA，比PCR更灵敏。 等利用LAMP扩增弓形虫B1和OWP基因检测水中弓形虫，可检出0.1个速殖子。

4.3.3 DNA探针

布兰科等人。 建立了RH株弓形虫基因文库，筛选出重复片段，并以32P标记为探针。 通过点杂交可检测到超过80pg的纯化弓形虫DNA。 夏爱迪还建立了弓形虫人株（ZS-2）的弓形虫基因库，筛选出1.1kb特异DNA片段，并使用32P标记作为探针检测弓形虫，纯化弓形虫DNA灵敏度为500pg 。 安吉尔等人。 使用ABGTg7标记的探针杂交检测急性弓形虫脑炎患者的DNA，灵敏度为66.7%。 目前，用于检测弓形虫的探针大多是特异性DNA克隆片段或人工合成的寡核苷酸探针。 虽然灵敏度高，但其制备需要一定的条件，且成本较高，不易推广。

分子生物学诊断是一种非常灵敏和特异的方法，但对测试环境和操作人员技能要求较高，影响其结果的因素较多，且成本较高，不利于推广。 实际操作中，血清学检测仍是主要方法。