聚合酶链式反应PCR扩增DNA片段实验目的实验原理实验仪器材料与试剂实验步骤实验结果与讨论实验目的掌握PCR反应的原理及技术实验原理聚合酶链式反应ion简称PCR技术是一种体外扩增特异DNA片段的技术利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝PCR技术在分子克隆遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用PCR技术实际上是在模板个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载DNA引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性变性－退火－延伸PCR反应分为三步变性在高温条件下DNA双链解离形成单链DNA退火当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链延伸在DNA聚合酶dNTPs和Mg2存在的条件下聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应以上三步为一个循环每一循环的产物可以作为下一个循环的模板几十个循环之后介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制数量可达到106-107个拷贝PCR技术的参数主要有7个聚合酶引物dNTPs反应buffer二价离子模板一价离子三实验仪器材料与试剂一仪器1PCR仪2台式离心机3微量取液器4紫外荧光观测仪5高压灭菌的微量离心管6DNA扩增系统7琼脂糖凝胶电泳系统二材料模板-TKS载体三试剂

43Taq酶引物1和-

四实验步骤1在管内配制25mul反应体系--es7M13-es7Taq酶模板1microl每管注做一管阴性对照即模板为灭菌的双蒸水或在管内配制50mul反应体系Ps2

引物引物酶05ul模板按下述循环程序进行扩增94℃53分钟1个循环94℃40秒56℃45秒72℃1分20秒32个循环94℃40秒52℃45秒72℃50秒30个循环72℃延伸7分钟4℃保温3扩增结束后取大约30muL-扩增产物进行1的琼脂糖电泳检测扩增情况分析结果并在紫外灯下切割扩增的琼脂糖胶块中的DNA片段放入管中4℃冰箱存放用于回收五实验结果与讨论PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的机会以免出现目的条带以外的杂带如退火温度过低也可能出现杂带使用3mg的条带进行1的琼脂糖凝胶电泳后各DNA条带自上至下分别为p100bp注意事项PCR反应是在一个在没有DNA污染的干净环境中进行一般而言只要能够得到可靠的结果模板纯化的方法越简单越好要使用新配制的或适当贮存的未使用过的试剂或缓冲液来提取核酸不要使用以前用于别的样品的试剂所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染配制试剂操作样品建立反应和以后的检测扩增产物过程中都使用手套所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏的去离子水高压灭菌后分装备用所有试剂都应该以大体积配制试

验一下是否满意然后分装成小份以确保实验间的连续性所有试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和离心管玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌PCR样品应在冰浴上化开并且要充分混匀扩增反应应当设计不加模板的阴性对照电泳时应当加标准DNA分子量标记Marker以估计产物的大小琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测主要基于在凝胶中加入溴化乙锭这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物使DNA在紫外光下发射很强的荧光而在紫外光下DNA发出的荧光是可见光在溴化乙锭足够的情况下荧光的强度正比于DNA的含量因而DNA的检测很方便如将已知大小和浓度的标准样品Marker作电泳对照就可估计出待测样品的大小和浓度1琼脂糖2TAE电泳缓冲液冰醋酸00ml稀释到电泳缓冲液溴化乙锭溶液10mgml室温下棕色瓶或铝铂纸包装保存溴酚蓝指示剂DNA样品加样缓冲液配制1的Agrose琼脂糖凝胶液加热使琼脂糖溶解待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉约60℃后加入约11000的1mgml溴化乙锭溶液至终浓度为05-1mugml后轻轻混匀勿起气泡避免剧烈摇晃产生气泡等溶液降温到50-55℃左右不烫手将其倒入电泳槽迅速在制胶槽一端插上梳子检查有无气泡在紫外观测仪上观察电泳结果根据需要切下DNA条带放

入15ml离心管中放入4℃-20℃冷冻保存以备以后的实验用长度寡核苷酸引物长度一般为含量GC含量一般在40-60碱基的随机分布引物中碱基的分布是随机分布的不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在引物自身引物自身不应存在互补序列否则引物自身折叠成发夹结构或引物本身复性这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合引物之间两引物之间不应有互补性尤其避免3rsquo端的互补重叠以防引物二聚体的形成引物的3rsquo端引物的延伸是从3rsquo端开始的不能进行任何修饰引物的5rsquo端引物的5rsquo端限定着PCR产物的长度它对扩增特异性影响不大因此可以被修饰而不影响扩增的特异性引物5rsquo端的修饰包括加酶切位点标记荧光等引入蛋白质结合位点引入突变位点插入与缺失突变序列和引入启动子序列等密码子的简并如扩增编码区域引物3rsquo端不要终止于密码子的第三位因为第三位容易发生简并会影响扩增特异性与效率引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70或有连续8个碱基同源避免产物的二级结构选择扩增片断时避开二级结构的区域现在有商品化的或免费的计算机软件程序可用来在特定的区域中选择引物序列在对所研究基因组全部序列并不知道的情况下这些程序既方便又实用分子生物学其它常用实验仪器1恒温摇床2超净工作台3高压灭菌锅4高速台式离心机5微量取液器