第五章 高效液相色谱法 1. 概述 2. HPLC仪器 包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统。 3. 流动相和固定相简介 4. 高效液相色谱方法应用一、建立HPLC分析方法的一般步骤 1、确立HPLC分析方法： 1）了解样品信息：样品的来源、性质（分子量、官能团、pH值和pKa值、溶解度和适合的溶剂等）。 2）明确分析目的：主成分的定性、定量；杂质分析；指纹图谱测定等。 3）样品的制备：去除样品中杂质，防止样品过量，适于HPLC分析（化学衍生法）。 4）HPLC方法确立：根据样品信息确定不同的方法。 2、色谱柱操作参数的选择 3、分离条件的选择 1）保留值和容量因子的选择 2）相邻组分的选择性系数和分离度的选择 3）流动相的选择 * 一、定义：高效液相色谱(HPLC)是采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成的色谱方法。 加压减少分析时间 减小填充物的粒径（3~10 ?m ）有效地增加柱效 高灵敏度的检测器：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 节 概述 二. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物；HPLC可以分析高沸点高分子量的化合物。

流动相的选择：GC采用的流动相只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相除了起运载作用外，还与固定相对组分的作用产生竞争。 节 概述 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 分离机理：HPLC除了有和GC一样的吸附色谱和分配色谱，还有离子交换色谱和空间排阻色谱等。 分离效率：HPLC柱效比GC高许多。 平衡时间：GC只要载气流速稳定即可分析，而HPLC需要平衡一段时间后才能进行分析。 节 概述 节 概述 三、HPLC的分离模式分离中等极性化合物。利用组分在极性固定相与弱极性或非极性流动相之间分配系数不同而分离，流动相极性增大，保留值降低。 正相键合相色谱分离几何异构体，不同族化合物，以及用于纯化制备。利用组分在固定相上的吸附能力不同而分离，采用非极性或弱极性流动相，保留值取决于功能团的类型和数目。 液－固色谱 应用 分离原理 模式 节 概述高分子、生物大分子等。以孔径一定的多孔凝胶为填充剂，样品按照分子尺寸差异进行分离，小分子保留值大，大分子保留值小。根据孔径尺寸范围不同，有一定的相对分子量分离范围。 凝胶色谱离子、离子型化合物或在一定条件下可离解的化合物。

组分离子与固定相平衡离子进行动态交换，不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。 离子交换色谱分离极性较小的样品，若利用二次化学平衡，可分离离子、离子型化合物，包括强酸强碱。采用非极性键合固定相和以水为底溶剂的极性流动相，利用非极性基团的疏水作用和极性基团在流动相中的二次化学平衡进行分离。 反相键合相色谱 应用 分离原理 模式 四. 应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。 极性增加 不溶于水 溶于水 非极性 离子 非离子极性 吸附 反向分配 分配 正向分配 离子交换 尺寸排阻 凝胶渗透 凝胶过滤 分 子 量 节 概述 各种HPLC方法的应用范围及对象 HPLC仪器包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。 第二节 HPLC仪器 HPLC工作过程 He 储液瓶 分布器 过滤 2?m 高压泵 入口检查 出口检查 脉流消除 抽气 过滤器 反压调节 压力计 注样阀 分离柱 到检测器 HPLC仪器详解 第二节 HPLC仪器 一、 高压输液系统 1）贮液器：流动相，溶剂过滤器（孔约2 ?m）。

2）脱气： 3）高压泵：对的要求；种类：恒压型和恒流型。 4）梯度淋洗装置：一个泵/两个或以上泵。 第二节 HPLC仪器 马达 往复式拉动 密封 溶剂 球阀 脉动阻 尼器 到色谱柱 机械往复式恒流泵 二、 进样系统HPLC的展宽多因一些柱外因素（进样系统、连接管道及检测器的死体积）引起。 1）注射进样：微量注射器。 装置简单、死体积小。进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：六通阀。 装入样品 出口 进样 采样环 泵入溶剂 进色谱柱 第二节 HPLC仪器 进样量可由样品管控制，进样准确，重复性好。 第二节 HPLC仪器 第二节 HPLC仪器 四、 检测器液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。 1)荧光检测器许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器灵敏度比UV检测器高2-3个数量级。 三、 色谱柱 1）色谱柱的要求：柱接头的死体积尽可能小。 2）柱的填充：主要为匀浆法。 2）紫外检测器：HPLC中，约有80%的物质可在254 nm/280nm处产生紫外吸收。在选择测量波长时注意：所选波长不能小于溶剂的使用波长。 第二节 HPLC仪器 石英窗 接色谱柱 UV 光电倍增管 废液 3）示差折光检测器 为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。

对温度变化敏感，不适于梯度淋洗。 光源 调零 光学零 参比 样品 平面镜 透镜 光电转换 记录仪 放大器 遮光板 第二节 HPLC仪器 第二节 HPLC仪器 4）安培检测器 采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它与反相色谱匹配。 5）电导检测器:电导检测器主要用于离子色谱的检测。 接参比电极 和对电极 接色谱柱 Teflon 塑料块 1 cm 工作电极 (Pt, Au, 碳糊) 第二节 HPLC仪器 ACTA ACTA 第二节 HPLC仪器 一、流动相 理想的溶剂应有下列特性： 1）对待测物具一定极性和选择性，对试样有足够的溶解度； 2）要与所使用的检测器相匹配； 3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加； 4）稳定性好，不与固定相互溶，没有不可逆反应，不与试样发生化学反应； 第三节 HPLC流动相和固定相 5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡； 6）价格便宜，易于精致和纯化，毒性小，不污染环境和腐蚀仪器。 液固色谱：极性大的试样用极性较强的流动相；极性小的则用弱极性流动相。 液液色谱：要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，固定相为极性物质时，选用非极性溶剂作流动相；固定相为非极性物质时，选用极性溶剂作流动相。

第三节 HPLC流动相和固定相 第三节 HPLC流动相和固定相 二、固定相载体由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。 1. 按承受压力分刚性固体：SiO2为基质，主要用于吸附、分配和键合色谱；硬胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。 第三节 HPLC流动相和固定相 2. 按孔隙深度分表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、 氧化铝、离子交换剂等)。适于常规分离分析。全多孔型：由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，适于复杂混合物的分离。 3. 按分离原理分：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。 第四节 HPLC应用 第四节 HPLC应用 第四节 HPLC应用 二、HPLC分析方法应用 1、定性分析 1）标准样品 2）色谱峰的保留值和吸收光谱 3）HPLC－MS 4）HPLC－NMR 第四节 HPLC应用 2、定量分析 1）峰高法：2）峰面积法： 3、制备型HPLC 1）制备型HPLC和分析型HPLC的比较 第四节 HPLC应用 低灵敏度（RI） 高灵敏度（UV） 检测器 往复泵 三种类型都可 泵 >100 ml, >100 mg 1 ml/min 1 ml/min 流速 全多孔硅胶30～50 mm 全多孔微粒硅胶5～10 mm 填料 (30～60)mm×(1～2)mm (100～300)mm×(2～6)mm 色谱柱 制备型 分析型 参数 *