紫外分光光度法测定中的含量

紫外分光光度法测定中维生素A的含量

一、原理

维生素A的异丙醇溶液在325nm波长处有*大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。

二、试剂

维生素A标准溶液：85%（或乙酸脂90%）经皂化处理后使用。称取一定量的标准品，用脱醛乙醇溶解使其浓度大约为1mg/mL。临用前需进行标定。取标定后的维生素A标准溶液配制成10 I.U/mL的标准使用液。

标定：取维生素A溶液若干微升，用脱醛乙醇稀释3.00Ml，在325nm处测定吸光度，用此吸光度计算出维生素A的浓度。

    C——维生素A的浓度g/mL

    A——维生素A的平均吸光度值

    S——加入的维生素A溶液量µL

    E——1%维生素A的比吸光系数：

无水脱醛乙醇：取2g溶入少量水中。取4g溶于温乙醇中。将两者倾入盛有1L乙醇的试剂瓶中，振摇后，暗处放置两天（不时摇动促进反应）。取上层清液蒸馏，弃去初馏液50mL。

：用95%乙醇配制成1%的溶液。

1:1氢氧化钾；0.5mol/L 氢氧化钾；无水：不含过氧化物；异丙醇

三、操作步骤

1、样品处理

皂化：称取0.5-5g充分混匀的于三角瓶中，加入10mL1:1氢氧化钾及20-40mL乙醇，在电热板上回流30分钟。加入10mL水，稍稍振摇，若有混浊现象，表示皂化。

提取：将皂化液移入分液漏斗，先用30mL水分两次洗涤皂化瓶（若有渣，可用经过脱脂棉过滤），再用50mL分两次洗涤皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振摇两分钟（注意放气），静止分层后，水层放入**分液漏斗。皂化瓶再用30mL分两次洗涤，洗液倒入**分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入**分液漏斗。重复操作3次。

洗涤：向**分液漏斗的醚液中加入30mL水，轻轻振摇，静止分层后放出水层。再加15-20mL0.5mol/L的氢氧化钾溶液，轻轻振摇，静止分层后放出碱液。再用水同样操作至洗液不使变红为止。醚液静止10-20分钟后，小心放掉析出的水。

浓缩：将醚液经过滤入三角瓶中，再用约25mL洗涤分液漏斗和两次，洗液并入三角瓶中。用水浴蒸馏回收，待瓶中剩余约5mL时取下减压抽干，立即用异丙醇溶解并移入50mL容量瓶中用异丙醇定容。

2、绘制标准曲线

分别取维生素A标准使用液0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00mL于10mL容量瓶中用异丙醇定容。以零管调零，于紫外分光光度计上在325nm处分别测定吸光度，绘制标准曲线。

3、样品测定

取浓缩后的定容液于紫外分光光度计上在325nm处测定吸光度，通过此吸光度从标准曲线上查出维生素A的含量。

四、计算                   

维生素A（I.U/100g）=                         

C——测出的样品浓缩后的定容液的维生素A的含量I.U/mL

V——浓缩后的定容液的体积mL

m——样品的质量g